噬菌体分型是病原细菌的一种重要生物分型方法，我所高守一院士早在七十年代带领小组建立了针对霍乱弧菌第七次大流行菌株的“噬菌体-生物分型方案”，将霍乱弧菌分成流行株和非流行株两类菌株，并进一步区分出更细致的亚型，对分离菌株的潜在致流行性具有重要的鉴定和预警意义。其中利用霍乱弧菌的五株分型噬菌体，将第七次大流行的O1群El Tor生物型霍乱弧菌分为32个噬菌体型。不同噬菌体型反映了细菌种内的遗传变异。其中，受体突变是菌株产生对噬菌体感染的抗性、形成不同噬菌体型的重要变异机制。腹泻病室开展了霍乱弧菌分型噬菌体识别受体的发现及其突变导致形成抗性菌株研究，发现噬菌体VP3通过双受体结合感染霍乱弧菌的机制。

　　在前期研究中，腹泻病室发现霍乱弧菌O1群El Tor型菌株的分型噬菌体VP3（属于T7噬菌体家族）能特异吸附在霍乱弧菌脂多糖的核心寡糖(OS)成分上，但是尚有部分霍乱弧菌虽具有完整OS基因簇、并能够被VP3噬菌体结合，但依然能够抵抗其感染。除此之外，OS缺失型霍乱弧菌仍表现出与VP3的弱结合，这提示霍乱弧菌还存在其他可能的识别受体。

　　在本项研究中，通过转座子插入，构建了霍乱弧菌（VP3敏感株）的突变库、并筛选到VP3抗性突变株，进而对抗性株的转座子插入位点准确定位和基因缺失突变验证，最终发现霍乱弧菌编码外膜蛋白TolC的基因突变能够导致菌株对VP3产生抗性。应用蛋白互作分析技术细菌双杂交系统及pull-down等，结合Western-blot分析，证明了TolC可以直接与VP3尾丝蛋白gp44相互作用，并准确定位VP3尾丝蛋白gp44的羧基端结构域是其与TolC互作的关键区域。通过对自然分离的霍乱弧菌VP3敏感株和抗性株的TolC蛋白序列比较、以及氨基酸位点定点突变实验等，确定TolC中第78、290、291位氨基酸残基参与TolC与gp44的结合。经蛋白结构预测，TolC外膜蛋白的这三个氨基酸残基位点暴露于细胞表面；且在霍乱弧菌的野生型VP3抗性株中，这三个位点及其周围氨基酸残基也出现频繁突变。噬菌体吸附测定显示，VP3敏感株在OS或TolC单突变时，各自残留部分VP3的吸附能力，但OS和TolC共同突变后，菌株完全丧失对VP3的吸附能力，并且也只有将两个基因同时回补后，才能使回补株完全恢复吸附感染VP3的能力。

　　这项研究揭示了VP3识别感染霍乱弧菌的过程是一种由外膜蛋白TolC和核心寡糖(OS)共同参与的双受体结合机制，并由此推测TolC形成的外膜孔道很可能是噬菌体VP3 DNA注入通道；那些表现为VP3抗性的流行野生型霍乱弧菌菌株，其VP3的受体TolC蛋白中结合VP3尾丝蛋白的位点发生了突变，导致菌株不结合VP3，抵抗了VP3的感染。这类菌株的噬菌体受体产生了变异，使得它们能够在含有VP3及其近缘噬菌体的环境中依然生存，获得生长优势。

　　对霍乱弧菌分型噬菌体受体及其突变产生抗性菌株的研究，最终是从分子生物学角度，对以霍乱弧菌噬菌体-生物分型为依据的两类菌株分型理论进行了解释，并进一步鉴定到霍乱弧菌自然分离菌株tolC基因突变及其生物学意义。

　　该文发表在2018年Journal of Biological Chemistry第11期中，樊粉霞副研究员为文章第一作者，李旭、逄波、李哲、章丽娟、李杰、张京云、闫梅英、梁未丽以及北京生命科学研究所的张程为参与作者，阚飙研究员为责任作者。

　　

　　O1群El Tor型霍乱弧菌分型噬菌体VP3吸附于敏感菌株表面

　　 

　　利用细菌双杂交、pull down结合Western blot技术证明霍乱弧菌TolC与VP3的尾丝蛋白gp44互相作用，以及吸附实验展示VP3对霍乱弧菌不同受体突变株的吸附能力

　　 

　　VP3的受体蛋白TolC结构预测（三聚体形式），显示三个氨基酸突变位点（A78、G290、E291）的分布

　　（腹泻病室 樊粉霞供稿）